היום הקדוש ביותר בשנה, בו מוחל הקדוש ברוך הוא לכל מי ששב בתשובה. כל ישראל צמים ביום זה, מסמוך לשקיעת החמה של ערב יום כפור עד מעט אחרי צאת הכוכבים שבמוצאי החג. משתדלים שגם הילדים מגיל 9 ואילך יצומו לפחות כמה שעות כפי יכלתם, וכשבגרו אחרי גיל בר ובת מצוה הם חייבים מהתורה בצום שלם. בתי הכנסת מלאים במתפללים, אנשים נשים וטף, ורובם לובשים בגדי לבן כדי להתדמות למלאכים. יום הכפורים חייב בחמש תפלות: ערבית, שחרית, מוסף, מנחה ונעילה (וראה לקמן).
 
בנוסף לאיסור אכילה ושתיה, יש ביום הכפורים עוד איסורים שגזרו חכמים, ומהם: שלא לרחוץ את הגוף או חלק ממנו במים ושלא לנעול נעלי עור (ראה פירוט בפרק הצומות, בפסקה "עינויים נוספים בימי הצום").
 
בבית המקדש היה הכהן הגדול עושה ביום זה את "סדר עבודת יום הכפורים" (כמתואר ב"סדר העבודה" שבתפלת מוסף). בין העבודות המיוחדות: הקטרת הקטורת ב"קדש הקדשים", והגורל שהיו עושים על שני שעירים. בגורל זה זכה אחד השעירים להיות קרבן לה', והשני להשלח להר עזאזל (במדבר יהודה), שם העלו אותו לצוק גבוה והוא התגלגל למטה ונשא עליו את כל עוונות בית ישראל, שהתכפרו במיתתו.
 
חכמינו זכרונם לברכה אומרים ש"השטן" בגימטריא 364, ואילו בשנה (שנת החמה) יש 365 ימים. זאת מאחר שביום אחד בשנה, יום הכפורים, אין לשטן שליטה והוא אינו יכול לקטרג בו על עם ישראל.